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鸡胚流感疫苗工艺及质量控制

来源:未知 作者:admin 时间:2017-02-21 09:59 点击:
 
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1.概述

流感病毒是每年全球流行病的始作俑者,这个病毒感染全球范围内数百万的人,导致严重疾病和死亡。而注射疫苗依旧是预防和控制流感主要的,最有效的方法。

流感病毒有三种类型(A,B,和C)比较容易感染人类。它是拥有片断,负链RNA基因组的正粘病毒科家族的成员。流感A和B基因组的8个RNA片断编码病毒蛋白:PB1,PB2,PA,M1,M2,NSNA,HA和NP。

根据最常见的表面抗原,流感A型病毒被分为不同亚型:血球凝集素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)。迄今为止,17种HA和九种NA糖蛋白亚型被确认。

由于流感病毒的高突变率,疫苗制造商必须每年重新变更毒种生产疫苗,来确保在现存于疫苗和流行毒株中的血球凝集素和神经氨酸之间一致。现有几种类型的流感疫苗:灭活流感疫苗和减毒流感疫苗。三价灭活流感疫苗有三种类型:全病毒,裂解病毒和亚单位。目前流感疫苗以裂解疫苗为主。

 
 
2
 
2.鸡胚流感疫苗情况

以鸡胚为基础的生产系统已经被应用了六十多年,并且它依旧是用来生产500,000,000疫苗最广泛的方法。

2.1
鸡胚流感疫苗上市情况

二十世纪40年代建立鸡胚流感疫苗生产以来,到目前为止大多数流感疫苗还都是以鸡胚为基础的。灭活和减毒流感疫苗有相似的以鸡胚为基础生产工艺。2003年,FDA批准了鼻内用流感疫苗的商品化,它是第一个减毒流感病毒三价疫苗。

2.2
鸡胚流感疫苗的工艺流程及质量控制

2.2.1工艺点概述

鸡胚尿囊液:9-11日龄鸡胚接种流感病毒,经过48-72小时培养后病毒增殖后,收集鸡胚尿囊液约10ml/胚。现在国内厂家每批鸡胚量在8-20万枚,此处收获尿囊液量大概在800-2000升。

澄清:此处主要是去除尿囊液中的有形成分,有的工艺是使用连续流高速离心方法(转速1万转以上),但此方法操作麻烦且会损失几升料液,对物料也不是绝对密闭在一定程度上增加了生物负荷。现在有的厂家用过滤的方式替代了离心方式。由于尿囊液里面成分复杂,大多数厂家会采用几步过滤的方法,目的在于降低在此步骤的微生物负荷,去除卵黄等杂质以提高超滤膜包效率;相对澄清的料液会使灭活剂(一般是甲醛)更有效率。在使用膜过滤的方法时,我们也要平衡去除杂质降低微生物对病毒收率的影响。基于这个考虑,切向流微滤得到了应用,此方法使用切向流方式可提高了过滤效率。

灭活:灭活剂使用基本上是使用甲醛,灭活在工艺中添加不太一样,图一的四个位置都有厂家添加。从灭活工艺可控角度,甲醛加入的位置靠后,甲醛灭活的过程越可控。因为甲醛添加是按照料液体积比添加的,当料液中杂质少了,病毒更纯,单位甲醛作用病毒的效果更强。

超滤:超滤方法是疫苗纯化的重要方法之一,在此步骤可去除大量小分子蛋白,估计去除率会在至少在60%以上。去除率取决于超滤的孔径(现在常用的孔径300、500、750KD)和超滤前物料的状况(图1)。该产品病毒是在鸡胚尿囊腔内生长,生长过程与细胞基础的疫苗不同,不是绝对无菌环境,所以工艺过程中降低微生物负荷是工艺过程关注点之一。

2。2。2质量控制

鸡胚尿囊液内的杂蛋白成分复杂并混有卵黄这使纯化过程有一定难度。且由于鸡胚的质量控制难度大,会出现不同批次的批间差异大,对纯化工艺的潜力有一定的要求。

药典要求病毒收获液微生物限度小于105CFU/ml标准及在原液除菌过滤前微生物限度小于10CFU/ml,供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物无毒性。这个标准促使客户在此处增加0.45um切向流微滤,0.45um或0.2um减菌级过滤以达到质量标准。

卵清蛋白标准500ng/ml,内毒素含量20EU/ml:卵清蛋白和内毒素含量控制实际贯彻流感生产全过程,在上游需要对鸡胚原材料的控制,在病毒接种时使用抗生素也是好的方法。在纯化过程中超滤是可以去除大量的小分子蛋白包括卵清蛋白(50KD左右)和部分内毒素(80KD),此过程使用大量的缓冲液去洗率是有效的方法。上述提到的300KD超滤和100KD超滤分别可以20倍和10倍洗率。在实际操作过程中会遇到使用一段时间后,超滤效率下降,卵清蛋白及内毒素有升高的趋势。通常是由于膜包长时间使用后堵塞,造成实际孔径已经达不到标称孔径,而此时的水通量反应不出来这个变化。所以使用过程中有效的清洗方法,提高NaOH浓度到1M,温度提高到40度充分循环,并长时间的浸泡是好的方法。

裂解剂含量:药典提到三种裂解剂聚山梨酯80小于80ug/ml, Triton X-100和Triton N-101小于350ug/ml。此处去除主要在100KD超滤过程中去除。

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