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单克隆抗体的HRP的标记方法原理与步骤

来源:Flarebio 作者:转载 时间:2017-03-13 11:26 点击:
 
下面福来生物小编就为大家介绍单克隆抗体的HRP标记实验步骤:(标记5mg单抗为例)
 
本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig结合,99%的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法。
 
原理:经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
 
1、5.0mg的HRP溶于0.5ml的双蒸水中此时溶液为棕红色;
2、加入0.5ml  NaIO4(0.06M,高碘酸钠),此时溶液颜色变为草绿色;
3、4度静至30min;
4、加入0.16mol/L的乙二醇0.5ml终止氧化反应,室温避光静至30min,溶液颜色变为棕黄色;
5、加入5mg/ml的IgG 1.0ml,此时溶液的棕黄色变浅;
6、用0.05M PH 9.5的碳酸盐缓冲液,至4度冰箱磁力搅拌透析过夜;碳酸盐缓冲液:Na2Co3 3.18g NaHCo3 5.88g 加2L双蒸水溶解。
7、将液体从透析袋中吸出,加入5mg/ml NaBH4 0.2ml(新配);
8、4度静止2h;
9、加入等体积的饱和硫酸铵ph7.2(慢慢加入),4度放置30min;
10、10000rpm/min离心10min,丢弃上清;
11、沉淀用pb(20mM,PH7.4)重悬,并用PB透析过夜;  PB:Na2HPO4.12H2O  7.16g  NaH2PO4 3.12g 用2L双蒸水溶解。
12 10000rpm/min离心10min。将上清定容5ml,分装上清-20度冻存。
 
戊二醛二步法
 
1. 原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
  
2. 标记步骤:
       
(1)称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室温静置过夜。
 
(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟,收集棕色流出液。如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌。
 
(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
 
(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3?小时。
 
(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。
 
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。
 
(7)3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
 
将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。
 
3. 结果判定:
 
(1) 定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。
 
(2) 定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程1cm)。
 
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
 
IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
 
         酶量(mg/ml)   IgG量(mg/ml)   酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4
          40,000       160,000   IgG量
 
(3) 本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有2~4%的酶与蛋白质结合。
 
4. 试剂及器材:
 
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸馏水至200ml。
 
(2) 1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
 
(3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液:取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
 
(4) 0.2M赖氨酸溶液:称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。
 
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。
 
(6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
 
(7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG,MW2000)。
 
(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
 
(9) HRP(RZ>3.0)。
 
(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
 
(11) 搅拌器,分光光度计,离心机。
 
(12) 透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。
 

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