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Antibody class

  • 基本概念
    抗原
    指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合,发生免疫效应(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种,一是诱导免疫应答的能力,也就是免疫原性,二是与免疫应答的产物发生反应,也就是抗原性。
    抗体
    免疫球蛋白子家族成员,在淋巴细胞表面,动物体外分泌和血管外流质中存在着不同种类的免疫球蛋白,抗体则是母体受外来的物质或者内源性的某些物质刺激而产生的母体蛋白。这种效应是母体用来抵御外来入侵的物质或者有机体而保护自身的一种方式,在这个过程中,B-淋巴细胞能够使用一种特殊的受体识别并绑定抗原决定簇,从而促使一系列分裂和分化过程,使B-淋巴细胞变为体细胞,正是这些淋巴细胞或者体细胞合成了抗体。
    多克隆抗体
    用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物,即多克隆抗体,也称之为第一代抗体。
    单克隆抗体
    由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群,可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体,也称之为第二代抗体。
    基因工程抗体
    采用基因工程的手段研究抗体与功能的关系,并对抗体基因进行改造和重组等,由此制备出的基因工程抗体,也称之为第三代抗体。
    蛋白免疫印迹杂交WB(Western Blot)
    是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜(blot)上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
    免疫组织/细胞化学IHC /ICC(Immunohistochemistry/Immunocytochemistry)
    是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究。
    免疫荧光IF (Immunofluorescence)
    是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪测定含量。
    免疫沉淀IP(Immunoprecipitation)
    主要是用于抗原或抗体的定性检测,以及纯化目的蛋白质的常规方法。其基本原理是利用抗原与抗体免疫反应,在蛋白质提取液中加入与抗原(目的蛋白质)特异性结合的抗体,抗原与抗体将形成免疫复合物,再与蛋Protein A/G 共同孵育后,免疫复合物经过纯化,洗脱后进行SDS-PAGE及Western blotting分析,从而达到纯化目的蛋白质、定性检测抗原或抗体的目的。
    流式细胞术FCM(Flow Cytometry)
    利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速(每秒可达1000-10000个)的定量分析和分选(纯度可达99%以上)的技术,可对单个细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分类。
    一抗
    一抗就是能和非抗体性抗原特异性结合的免疫球蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。
    二抗
    二抗是能和抗体结合,即抗体的抗体,其主要作用是检测抗体的存在,放大一抗的信号。二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质,去免疫异种动物,由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。
    X抗Y抗体
    x是宿主,注射到什么体内,x就是什么,抗原来源是什么,y就是什么。如兔抗人某某抗体是指将人的蛋白注入兔子体内产生的抗体(例:将人IL8注入兔子体内产生的抗体叫做兔抗人IL8抗体)。
  • 制备流程
    多克隆抗体制备流程
    1.抗原制备

    广西11选5开奖查询一般的科研实验中,我们经常使用的抗原有天然蛋白、重组蛋白、偶联的多肽、偶联的小分子化合物等。

    2.抗原乳化

    将抗原与弗氏佐剂按1:1混合后进行乳化,其中一免采用弗氏完全佐剂,以后均采用弗氏不完全佐剂。乳化时间在半个小时左右,当其乳化半小时后,取出搅拌器头,在一装有水的容器口轻轻敲一下,让搅拌铁丝上粘有的乳化后的免疫原掉一滴到水里,其遇水不扩散时即已乳化好。如还有扩散现象,继续乳化。

    3.免疫动物

    免疫所用的动物尽量选择适龄的雄性动物(多克隆抗体制备动物通常选雄性兔)。将乳化好的抗原转入2.5mL的注射器中,排除注射器中的气泡,在兔背部进行多点皮下注射。每次注射量在300-500ug。

    4.抗血清鉴定

    四免后三到五天少量取血进行效价检测,确认免疫是否成功。

    5.抗血清制备

    经抗血清鉴定免疫成功以后,杀死实验动物,收集全部血清。

    6.抗血清纯化

    广西11选5开奖查询选择合适的方法纯化抗血清,得到抗体。

    单克隆抗体制备流程
    1.免疫动物

    免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。

    2.细胞融合

    处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,通过细胞分离网制备B淋巴细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。

    3.选择性培养

    选择性培养的目的是筛选融合杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中,未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖。

    4.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

    在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存。

    5.单克隆抗体的大量制备

    单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。

  • 疑难解答
    多抗和单抗的区别?
    多抗是多个B细胞克隆产生的针对多种抗原表位的多种抗体混合物,单抗是一个B细胞克隆产生的针对一种抗原表位的的单一抗体。
    多抗较单抗的优势是什么?

    A.首次制备成本低廉

    B.制备所需技术和技能要求不高。

    C.制备周期短。

    D.能识别一个抗原上的多个表位,可在IP等实验中获得更好的结果。

    E.多抗有助于放大低表达水平的靶蛋白信号,因为靶蛋白可在多个表位上结合不止一个抗体分子。

    F.能识别出与免疫原蛋白质具有高同源性的蛋白质,或者从非免疫原物 种的组织样品中筛选靶蛋白,例如当未测试物种中的抗原性质未知时,有时会使用多克隆抗体。

    G.可识别多个结构域,即使原始抗原的一些空间结构或者序列发生小变化或者部分抗原决定簇变化,仍可以识别抗原,因此有更大的适应性,例如对于蛋白多聚体或者微变性蛋白的识别;是识别变性蛋白的首先。

    多抗较单抗的劣势是什么?

    A.相对容易产生批次间差异

    B.存在大量非特异性抗体,有时可能在某些应用中产生背景信号,当然我们可以推荐客户选择抗原亲和层析,最大程度的降低这种问题的存在。

    C.重新制备成本相比单抗较高。

    IHC和WB验证蛋白质上有什么区别?
    免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;WB可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。
    为什么免疫后没有效价或免疫后效价低?
    可以从这几个方面一一考虑:

    1.设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。对于前一种情况应该重新设计抗原,设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列,可以设计短肽然后与载体蛋白偶联之后免疫;对于后一种情况,首先确认小分子物质是否已经正确和载体蛋白偶联,如果偶联没有问题,可以更换其它的载体蛋白,一般来说KLH 是所有载体中优先考虑的蛋白

    2.免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短,各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果。

    3.免疫佐剂不合适。TiterMax 等佐剂在免疫时,对于某些抗原可能效果不佳,弗低佐剂也不能保证完全有效,此时可以考虑更换佐剂尝试。

    4.免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受,过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。

    5.免疫途径不合理。对于有些免疫原性弱的抗原,可以考虑脾内免疫方法。

    6.测效价的过程存在错误操作,尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时,一抗(即血清)稀释梯度尽量放宽,一般建议从1:200或1:1000开始作梯度稀释。对于小分子物质,效价达到1:2000仍可视为免疫功。

    为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少?
    可以从这几个方面考虑:

    1.免疫用动物品系不正确或者品系不纯。免疫用动物一般应该与骨髓瘤来源动物是相同品系,例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C 小鼠,同时必须使用品系纯正的小鼠。

    2.培养基中加入过高浓度的HAT,或者仅A 的浓度过高或HT 的浓度过低,建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT 浓度筛选。

    3.培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。

    4.未正确制备饲养层细胞。

    5.接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。

    6.融合后,未及时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜欢把融合的细胞先放在培养瓶中培养,然后再滴到96孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长,也可能出现克隆率少的情况。

    7.细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物,也应该考虑是否有支原体污染,条件允许的可以做支原体检测。

    8.细胞培养条件不正确,确保细胞培养在恒定的37度恒温恒湿的环境,同时保证CO2浓度在4-5%左右。

    为什么融合后得不到阳性克隆?
    可能的原因:

    1.动物未免疫成功就进行了融合。

    2.融合后得到的克隆较少,故得到阳性克隆的机率也较小。

    3.筛选克隆方法不正确。例如有些小分子物质不能直接包被到酶标板上,使用了不合适的二抗等诸多因素。

    4.抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似,或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。例如,如果需要制备抗BSA 的单抗,则培养杂交瘤的培养基中能含有牛血清,否则牛血清中的BSA 直接与抗体相结合,最后做ELISA 筛选时无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其他动物的血清或者使用无血清培养基。制备酪蛋白的单抗,做ELISA 筛选时,二抗的稀释液不能使用脱脂奶粉。

    5.其它所有能影响ELISA 等相关筛选手段的因素。

    为什么我的细胞生长很慢?
    可能的原因:

    1.使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT 或HT。对于血清,可能需要从多个厂家选用多个批次试用,选择较好的批次进行实验。在试用血清的时候,一般使用较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验,根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。

    2.使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。

    3.细胞污染。

    我的克隆原来是阳性的,为什么后来转为阴性了?
    首先要注意的是,正常情况下,杂交瘤不是绝对稳定的,容易发生染色体丢失的情况,尤其是当细胞移到新环境中生长,如从小孔扩大到大孔,或者复苏操作时,更容易发生阳性变为阴性。但是也有一些方法尽量减少阳性变为阴性。一般可以从这几个方面加以注意:

    1.尽量使细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换,一般而言,当细胞增长到一定密度时,培养基就开始变颜色,此时就要准备换培养基。除换培养基,同时应该控制好细胞密度,可以吹走过多的细胞,使新加入的培养基不至于很快被消耗。

    2.对于重要的细胞株,每一步都把阳性的细胞保种。

    3.不要频繁操作细胞,当细胞生长密度不是很大时,不要频繁操作,否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。

    4.对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆,并将每一次的亚克隆株也作冻存。

    5.当细胞被支原体微生物污染,也会发生由阳性转为阴性的情况。

    为什么我的细胞总是污染?如何救活污染的细胞?
    培养细胞出现污染,几乎是每个细胞培养技术员容易出现的问题。防止细胞污染,就是确保培养环境无污染,使用的所有试剂都无污染源,同时提高操作时的警惕性。但是一般情况下,如果不是很重要的项目,建议把污染的细胞立即处理掉,不要因小失大,以免造成更大的污染事故。对于非常重要的细胞株,我们可以尝试以下方法:

    1.体外用抗生素。细胞的污染大致可以分三类:细菌污染、真菌污染和支原体污染。在显微镜下仔细观察,这三种微生物污染区别还是比较明显的:如果有大量运动的微生物铺在培养介质的底部,呈较大幅度运动,并且培养基在短时间内变酸而且浑浊,则很可能是细菌污染;如果在显微镜下观察有典型的斑状或丝状微生物(注意与塑料屑、棉花屑和琉璃纤维区别开),基本上观测不到明显的运动,很可能是真菌污染;如果看不到明显的微生物,并且培养基没有明显的颜色上的变化,而细胞状态很差,细胞边缘极其不光滑,而且细胞又莫名其妙地死亡或生长极其缓慢,则有可能为支原体污染,但不能下明确的结论,如果非常需要知道是否为支原体污染可以使用相关的试剂盒进行检测。
    对于细菌污染,可以把青霉素的浓度提高至10倍左右,链霉素浓度提高至5-10倍,也可以用10倍浓度的卡那霉素替代链霉素。对于真菌污染,可以在培养基中加入约5μg/ml 的咪康唑(注射用达克宁)抑制。对于这两种情况的污染,采用上述方法处理后,待细胞稍有好转,并且没有发现更大规模的污染时,需要尽快重复上面的处理步骤。需要注意的是,此时细胞生长受抗生素的影响比较大故而生长很慢。如果多次传代均未发现污染复发,可以慢慢降低抗生素浓度直至常规浓度,确定是否完全根除污染。最好进行一次有限稀释的亚克隆操作,以获得更加纯净的细胞株。而对于支原体污染,则比较麻烦,一般的抗生素是很难解决的,对于轻度的污染,可以尝试使用60μg/ml 的泰乐菌素和10μg/ml 左右的环丙沙星交替处理。如果得到明显的缓解,建议马上做亚克隆操作,看看是否得到污染根除的细胞株,如果此方法无效,则不能单纯利用抗生素来解决污染问题。

    2.体内法。这个办法很简单,原理就是动物体有强大的免疫系统,一般的微生物都可以被动物体消灭。具体操作和制备腹水的方法完全一样,即先用IFA 或石蜡制敏小鼠,数天后腹腔注射污染的杂交瘤。如果情况紧急,致敏当天注射杂交瘤也行。一般十天后小鼠产生腹水,在超净台无菌采出腹水,其中即含有大量的杂交瘤细胞,一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射杂交瘤,十几天后可以看到实体瘤形成,也可以在超净台上无菌采摘,然后放回培养板或培养瓶等容器内培养。

    为什么我的杂交瘤细胞不能制备腹水或者制备的腹水中没的抗体或腹水没有效价?
    不能制备腹水的原因大部份是人为的原因:

    1.致敏不正确,例如使用了不正确的致敏剂,或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久。

    2.杂交瘤的接种位置不正确,没有打到腹腔,而是打到了皮下。

    3.接种的杂交瘤细胞数量太少或者细胞状态不好。一般不应少于10万个细胞,建议在100万个细胞左右为宜。

    4.制备腹水小鼠的种系与参与融合的细胞来源的动物种系相差太远,以至制备腹水的小鼠对杂交瘤有强大的免疫反应将其杀死,建议更换小鼠品系重新接种。

    对于腹水没有效价,可能的原因:

    1.制备腹水的杂交瘤极不稳定,打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。

    2.致敏小鼠时采用了错误的致敏剂,如使用了弗氏完全佐剂,这时即使不打杂交瘤,小鼠也会产生腹水。

    3.极其罕见的情况,就是此杂交瘤生产的抗体可以与小鼠体内的分子相互作用,于是杂交瘤产生的抗体被小鼠的相关蛋白中和,这种情况下,小鼠的身体可能会出现明显的异常。

    4.检测腹水效价的实验方案有问题,或者腹水稀释比过大。

    具体应用中,一抗和二抗怎么选择?
    根据指定的目标抗原,从具体应类型(WB,IHC等)、样品性质、样品种类、抗体宿主、是否需要标记等方面综合考虑。如果您的一抗来源于兔,那么二抗就应该选择抗兔的。
    HRP和AP标记的二抗有什么区别?
    HRP和AP是酶,二抗上连接了酶,要有相应的底物才能显色,可以用化学发光免疫检测底物 ,根据酶系来选择底物,可以分为HRP和AP底物系统,HRP分子量小,稳定,便宜,反应快速,而AP分子量大,酶促反应慢。
    常用的抗体防腐剂有哪些?
    常用抗体防腐剂有NaN3和Proclin 300。
    常用的抗血清纯化方法有哪些?
    盐析法(辛酸沉淀法、辛酸硫酸铵沉淀法)和亲和层析法(抗原亲和层析法,蛋白A/G亲和层析法)。
    为何有些抗体做WB检测到的条带与理论大小相比有区别?
    导致这一结果的主要原因有:

    1.天然蛋白存在某些修饰情况,如磷酸化、糖基化等,这些修饰都会导致蛋白质的分子量增加。

    2.有些蛋白存在不同的isform,每个isform得到的蛋白大小都有所差别。

    3.氨基酸组成,不同氨基酸所带电荷不一样,导致相对电荷不同,迁移率有所差异,通过SDS-PAGE电泳检测的大小会有所偏差。

    广西11选5开奖查询4.多聚体(二聚、三聚等),多聚体形式的蛋白常常会抵制WB所做的还原条件,还原不完全等会导致检测条带偏大。

    5.翻译后的剪切,有些蛋白以前体的形式合成或者带有信号肽,翻译后剪切掉前肽或者信号肽,导致检测条带变小。

    怎么确定某个抗体能否用于其他未经验证过的种属?
    可以通过Blast将免疫原序列和客户预期种属该蛋白的序列进行对比,如果发现同源性大于等于85%,同时有较大段100%同源的序列,则该抗体能成功应用与您想检测种属蛋白的可能性较高,但是我们不保证100%成功。
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